प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में प्रतिदीप्ति फ़िल्टर एक आवश्यक घटक है। एक विशिष्ट प्रणाली में तीन बुनियादी फिल्टर होते हैं: एक उत्तेजना फिल्टर, एक उत्सर्जन फिल्टर और एक डाइक्रोइक दर्पण। इन्हें आमतौर पर एक क्यूब में पैक किया जाता है ताकि समूह को माइक्रोस्कोप में एक साथ डाला जा सके।
प्रतिदीप्ति फ़िल्टर कैसे काम करता है?
उत्तेजना फ़िल्टर
उत्तेजना फिल्टर एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को प्रसारित करते हैं और अन्य तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करते हैं। उनका उपयोग केवल एक रंग को अनुमति देने के लिए फ़िल्टर को ट्यून करके विभिन्न रंगों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। उत्तेजना फ़िल्टर दो मुख्य प्रकारों में आते हैं - लॉन्ग पास फ़िल्टर और बैंड पास फ़िल्टर। एक्साइटर आमतौर पर एक बैंडपास फिल्टर होता है जो केवल फ्लोरोफोर द्वारा अवशोषित तरंग दैर्ध्य को पार करता है, इस प्रकार प्रतिदीप्ति के अन्य स्रोतों की उत्तेजना को कम करता है और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बैंड में उत्तेजना प्रकाश को अवरुद्ध करता है। जैसा कि चित्र में नीली रेखा द्वारा दिखाया गया है, बीपी 460-495 है, जिसका अर्थ है कि यह केवल 460-495एनएम के प्रतिदीप्ति से गुजर सकता है।
इसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के रोशनी पथ के भीतर रखा जाता है और फ्लोरोफोर उत्तेजना सीमा को छोड़कर प्रकाश स्रोत की सभी तरंग दैर्ध्य को फ़िल्टर करता है। फ़िल्टर न्यूनतम ट्रांसमिशन छवियों की चमक और प्रतिभा को निर्धारित करता है। किसी भी उत्तेजना फ़िल्टर के लिए न्यूनतम 40% संचरण की अनुशंसा की जाती है ताकि संचरण आदर्श रूप से >85% हो। उत्तेजना फिल्टर की बैंडविड्थ पूरी तरह से फ्लोरोफोर उत्तेजना सीमा के भीतर होनी चाहिए जैसे कि फिल्टर की केंद्र तरंग दैर्ध्य (सीडब्ल्यूएल) फ्लोरोफोर की चरम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के जितना संभव हो उतना करीब हो। उत्तेजना फ़िल्टर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) पृष्ठभूमि छवि अंधेरे को निर्देशित करता है; OD इस बात का माप है कि कोई फ़िल्टर ट्रांसमिशन रेंज या बैंडविड्थ के बाहर तरंग दैर्ध्य को कितनी अच्छी तरह से अवरुद्ध करता है। न्यूनतम 3.0 OD की अनुशंसा की जाती है लेकिन 6.0 या इससे अधिक का OD आदर्श है।
उत्सर्जन फ़िल्टर
उत्सर्जन फिल्टर नमूने से वांछनीय प्रतिदीप्ति को डिटेक्टर तक पहुंचने की अनुमति देने के उद्देश्य से काम करते हैं। वे छोटी तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करते हैं और लंबी तरंग दैर्ध्य के लिए उच्च संचरण रखते हैं। फ़िल्टर प्रकार भी एक संख्या के साथ जुड़ा हुआ है, उदाहरण के लिए BA510IF चित्र (हस्तक्षेप बाधा फ़िल्टर) में, यह पदनाम इसके अधिकतम संचरण के 50% पर तरंग दैर्ध्य को संदर्भित करता है।
उत्तेजना फिल्टर के लिए वही सिफारिशें उत्सर्जन फिल्टर के लिए भी लागू होती हैं: न्यूनतम ट्रांसमिशन, बैंडविड्थ, ओडी और सीडब्ल्यूएल। आदर्श सीडब्ल्यूएल, न्यूनतम ट्रांसमिशन और ओडी संयोजन के साथ एक उत्सर्जन फिल्टर सबसे गहरी संभव अवरोधन के साथ सबसे उज्ज्वल संभव छवियां प्रदान करता है, और सबसे कमजोर उत्सर्जन संकेतों का पता लगाना सुनिश्चित करता है।
डाइक्रोइक दर्पण
डाइक्रोइक दर्पण को उत्तेजना फिल्टर और उत्सर्जन फिल्टर के बीच 45° के कोण पर रखा जाता है और डिटेक्टर की ओर उत्सर्जन संकेत संचारित करते समय फ्लोरोफोर की ओर उत्तेजना संकेत को प्रतिबिंबित करता है। आदर्श डाइक्रोइक फिल्टर और बीम स्प्लिटर्स में अधिकतम प्रतिबिंब और अधिकतम ट्रांसमिशन के बीच तेज संक्रमण होता है, जिसमें उत्तेजना फिल्टर की बैंडविड्थ के लिए >95% प्रतिबिंब और उत्सर्जन फिल्टर की बैंडविड्थ के लिए >90% का ट्रांसमिशन होता है। आवारा-प्रकाश को कम करने और फ्लोरोसेंट छवि सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए, फ़्लोरोफोर के प्रतिच्छेदन तरंग दैर्ध्य (λ) को ध्यान में रखते हुए फ़िल्टर का चयन करें।
इस चित्र में द्विध्रुवीय दर्पण DM505 है, इसे यह नाम इसलिए दिया गया क्योंकि इस दर्पण के लिए अधिकतम संचरण के 50% पर 505 नैनोमीटर तरंग दैर्ध्य है। इस दर्पण का संचरण वक्र 505 एनएम से ऊपर उच्च संचरण, 505 नैनोमीटर के बाईं ओर संचरण में भारी गिरावट और 505 नैनोमीटर के बाईं ओर अधिकतम परावर्तन दिखाता है लेकिन फिर भी 505 एनएम से नीचे कुछ संचरण हो सकता है।
लॉन्ग पास और बैंड पास फिल्टर के बीच क्या अंतर है?
प्रतिदीप्ति फिल्टर को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: लॉन्ग पास (एलपी) और बैंड पास (बीपी)।
लॉन्ग पास फिल्टर लंबी तरंग दैर्ध्य संचारित करते हैं और छोटी तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करते हैं। कट-ऑन तरंग दैर्ध्य पीक ट्रांसमिशन के 50% पर मान है, और कट-ऑन के ऊपर सभी तरंग दैर्ध्य लंबे पास फिल्टर द्वारा प्रेषित होते हैं। इनका उपयोग अक्सर डाइक्रोइक दर्पण और उत्सर्जन फिल्टर में किया जाता है। लॉन्गपास फिल्टर का उपयोग तब किया जाना चाहिए जब एप्लिकेशन को अधिकतम उत्सर्जन संग्रह की आवश्यकता होती है और जब वर्णक्रमीय भेदभाव वांछनीय या आवश्यक नहीं होता है, जो आम तौर पर जांच के मामले में होता है जो पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस के अपेक्षाकृत कम स्तर वाले नमूनों में एकल उत्सर्जक प्रजाति उत्पन्न करता है।
बैंड पास फ़िल्टर केवल एक निश्चित तरंग दैर्ध्य बैंड को संचारित करते हैं, और अन्य को अवरुद्ध करते हैं। वे फ्लोरोफोर उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के केवल सबसे मजबूत हिस्से को प्रसारित करने की अनुमति देकर क्रॉसस्टॉक को कम करते हैं, ऑटोफ्लोरेसेंस शोर को कम करते हैं और इस प्रकार उच्च पृष्ठभूमि वाले ऑटोफ्लोरेसेंस नमूनों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करते हैं, जो लंबे समय तक चलने वाले फिल्टर पेश नहीं कर सकते हैं।
BestScope कितने प्रकार के प्रतिदीप्ति फ़िल्टर सेट की आपूर्ति कर सकता है?
कुछ सामान्य प्रकार के फ़िल्टर में नीला, हरा और पराबैंगनी फ़िल्टर शामिल हैं। जैसा कि तालिका में दिखाया गया है।
| फ़िल्टर सेट | उत्तेजना फ़िल्टर | डाइक्रोइक दर्पण | बैरियर फ़िल्टर | एलईडी लैंप तरंग लंबाई | आवेदन |
| B | BP460-495 | डीएम505 | बीए510 | 485एनएम | ·FITC: फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि ·एसिडीन ऑरेंज: डीएनए, आरएनए ·ऑरामाइन: ट्यूबरकल बेसिलस ·ईजीएफपी, एस657, आरएसजीएफपी |
| G | BP510-550 | DM570 | बीए575 | 535एनएम | रोडामाइन, टीआरआईटीसी: फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि ·प्रोपीडियम आयोडाइड: डीएनए ·आरएफपी |
| U | BP330-385 | डीएम410 | बीए420 | 365एनएम | ·ऑटो-प्रतिदीप्ति अवलोकन ·डीएपीआई: डीएनए स्टेनिंग ·होचेस्ट 332528, 33342: क्रोमोसोम धुंधलापन के लिए उपयोग किया जाता है |
| V | BP400-410 | डीएम455 | बीए460 | 405nm | · कैटेकोलामाइंस ·5-हाइड्रॉक्सी ट्रिप्टामाइन ·टेट्रासाइक्लिन: कंकाल, दांत |
| R | BP620-650 | DM660 | बीए670-750 | 640nm | ·Cy5 ·एलेक्सा फ्लोर 633, एलेक्सा फ्लोर 647 |
प्रतिदीप्ति अधिग्रहण में उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर सेट प्रतिदीप्ति अनुप्रयोगों में उपयोग की जाने वाली प्रमुख तरंग दैर्ध्य के आसपास डिज़ाइन किए गए हैं, जो कि सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले फ़्लोरोफोर्स पर आधारित है। इस कारण से, उनका नाम फ्लोरोफोर के नाम पर भी रखा गया है, जिसका उद्देश्य वे इमेजिंग के लिए हैं, जैसे डीएपीआई (नीला), एफआईटीसी (हरा) या टीआरआईटीसी (लाल) फिल्टर क्यूब्स।
| फ़िल्टर सेट | उत्तेजना फ़िल्टर | डाइक्रोइक दर्पण | बैरियर फ़िल्टर | एलईडी लैंप तरंग लंबाई |
| FITC | BP460-495 | डीएम505 | BA510-550 | 485एनएम |
| डीएपीआई | BP360-390 | डीएम415 | बीए435-485 | 365एनएम |
| ट्रिटक | BP528-553 | डीएम565 | बीए578-633 | 535एनएम |
| एफएल-ऑरामाइन | BP470 | डीएम480 | बीए485 | 450nm |
| टेक्सास रेड | BP540-580 | डीएम595 | बीए600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | डीएम593 | बीए605-675 | 560nm |
आप प्रतिदीप्ति फ़िल्टर कैसे चुनते हैं?
1. प्रतिदीप्ति फिल्टर का चयन करने का सिद्धांत प्रतिदीप्ति/उत्सर्जन प्रकाश को जहां तक संभव हो इमेजिंग अंत से गुजरने देना है, और एक ही समय में उत्तेजना प्रकाश को पूरी तरह से अवरुद्ध करना है, ताकि उच्चतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त किया जा सके। विशेष रूप से मल्टीफोटोन उत्तेजना और कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोप के अनुप्रयोग के लिए, कमजोर शोर भी इमेजिंग प्रभाव में बड़ा हस्तक्षेप करेगा, इसलिए शोर अनुपात के संकेत की आवश्यकता अधिक है।
2. फ्लोरोफोर के उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को जानें। एक प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट का निर्माण करने के लिए जो एक काली पृष्ठभूमि के साथ एक उच्च-गुणवत्ता, उच्च-विपरीत छवि उत्पन्न करता है, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर को उन क्षेत्रों पर न्यूनतम पासबैंड तरंग के साथ उच्च संचरण प्राप्त करना चाहिए जो फ्लोरोफोर उत्तेजना चोटियों या उत्सर्जन के अनुरूप हैं।
3. प्रतिदीप्ति फिल्टर के स्थायित्व पर विचार करें। ये फिल्टर तीव्र प्रकाश स्रोतों के प्रति अभेद्य होने चाहिए जो पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश उत्पन्न करते हैं जो विशेष रूप से एक्साइटर फिल्टर के "बर्नआउट" का कारण बन सकते हैं क्योंकि यह रोशनी स्रोत की पूरी तीव्रता के अधीन है।
विभिन्न फ्लोरोसेंट नमूना छवियाँ
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पोस्ट करने का समय: दिसम्बर-09-2022